Molekylærbiologiske forskningsmetoder og deres bruk

Molekylærbiologiske forskningsmetoder spiller en viktig rolle i moderne medisin, rettsmedisin og biologi. Takket være fremskritt innen studiet av DNA og RNA, er personen i stand til å utforske genomet til organismen bestemme det forårsakende middel, for å gjenkjenne den ønskede nukleinsyre i en blanding av syrer etc.

Molekylærbiologiske metoder. Hva er det?

Tilbake på 70-80-tallet av forskerne var den første til å tyde det menneskelige genom. Denne hendelsen ga støtet til utviklingen av genteknologi og molekylærbiologi. Studium av egenskapene til DNA og RNA har ført til at det er nå mulig å bruke disse nukleinsyrer i den hensikt å sykdom diagnose, studere genet.

Fremstilling av DNA og RNA

Molekylærbiologiske diagnostiske fremgangsmåter krever Utgangsmaterialet ofte denne nukleinsyre. Det er flere måter å velge disse stoffene fra cellene i levende organismer. Hver har sine fordeler og ulemper, og det bør tas i betraktning når man velger en fremgangsmåte for å isolere nukleinsyrer i ren form.

1. Fremstilling av DNA ved hjelp av Marmur. Metoden består i å behandle en blanding av alkohol stoffer utfelles resulterende rene DNA. Ulempen med denne metoden er bruken av korrosive stoffer, fenol og kloroform.

2. Isolering av DNA på bommen. Hoved stoff som er brukt her - er guanidintiocyanat (GuSCN). Det fremmer avsetningen av deoksyribonukleinsyre på spesialiserte underlag, hvorfra den deretter kan samles inn ved hjelp av en spesiell buffer. Imidlertid GuSCN - er en inhibitor av TCP, og til og med en liten del av det blir deponert i DNA kan påvirke forløpet av polymerase kjedereaksjon, noe som er viktig når man arbeider med nukleinsyrer.

3. Utfelling av urenheter. Fremgangsmåten skiller seg fra foregående ved at molekylene seg selv ikke er avsatt dehoksiribonukleinovoy syre og urenheter. For å gjøre dette, bruker du ionebyttere. Ulempen er at ikke alle stoffer kan avgjøre.

4. Masse screening. Denne metoden brukes i tilfeller der du ikke trenger å ha nøyaktig informasjon om strukturen av DNA-molekylet, og behovet for å få noen statistikk. Årsaken er at nukleinsyren strukturen kan bli ødelagt ved håndtering av vaskemidler, spesielt alkalier.

Klassifisering av forskningsmetoder

Alle molekylærbiologiske metoder for forskning er delt inn i tre hovedgrupper:

1. Amplification (ved hjelp av en flerhet av enzymer). Dette omfatter PCR - polymerase kjedereaksjon, som spiller en viktig rolle i mange av de diagnostiske fremgangsmåter.

2. Neamplifikatsionnye. Denne gruppen av metodene er forbundet direkte med arbeidet av nukleinsyreblandinger. Eksempler er 3 typer blots, in situ hybridisering, etc.

3. Metoder basert på erkjennelsen av signalet fra sonden molekyl som binder til en spesifikk DNA eller RNA probe. Eksempel - hybridisering system Hybride Capture Systemløsning (HC2).

Enzymer som kan benyttes i molekylærbiologiske forskningsmetoder

Mange molekylære diagnostiske teknikker involverer anvendelse av et bredt område av enzymer. Nedenfor brukes oftest:

1. restriksjonsenzym - "cut" DNA-molekylet til de nødvendige deler.

2. DNA-polymerase - syntetiserer en dobbeltkjedet deoksyribonukleinsyre molekyl.

3. Revers transkriptase (revers transkriptase) - brukes for å syntetisere DNA fra en RNA-templat.

4. DNA-ligase - er ansvarlig for dannelsen av fosfodiesterbindinger mellom nukleotider.

5. exonuclease - fjerner nukleotider fra endepartiene av deoksyribonukleinsyre molekylet.

PCR - den grunnleggende metode for DNA-amplifikasjon

Polymerase kjedereaksjon (PCR) er mye brukt i moderne molekylærbiologi. Denne fremgangsmåten, i hvilken et enkelt DNA-molekyl kan oppnås et stort antall kopier (forsterkende molekyl).

De viktigste funksjonene til PCR:

- diagnostisering av sykdommer;

- kloning av DNA-segmenter, Gene.

For å utføre en polymerasekjedereaksjon krever følgende elementer: første DNA-molekyl, en termostabil DNA-polymerase (Taq eller PFU), deoksyribonukleotid-fosfater (kilder til nitrogenbaser), primere (2-primer-1 DNA-molekyl) og i seg selv et buffersystem som kan utføre alle reaksjoner.

PCR består av tre trinn: denaturering, primerannealing og forlengelse.

1. denaturering. Ved en temperatur på 94-95 grader Celsius proshodit bryte hydrogenbindingene mellom de to kjeder av DNA, og som et resultat får vi to enkelt-trådede molekyler.

2. glødet primere. Ved en temperatur på 50-60 grader Celsius oppstår sjonsprimerne ved endene av enkelt-trådede nukleinsyremolekyler i henhold til type av komplementaritet.

3. Forlengelse. Ved en temperatur på 72 ° syntetiseres datter dobbelttrådet deoksyribonukleinsyre molekyler.

DNA-sekvensering

Molekylære biologiske undersøkelsesmetoder ofte krever kunnskap om sekvensen av nukleotider i et molekyl av deoksyribonukleinsyre. For å bestemme den genetiske koden sekvensert. Molekylær diagnostikk i fremtiden vil være basert på kunnskap i fastsettelsen av den menneskelige sekvens.

Følgende typer sekvensering:

• sekvensering ved hjelp av Maxam-Gilbert;
• Sanger-sekvensering;
• pyrosekvensering;
• nanoporovoe sekvensering.